Productontwikkeling voor personalized medicine bij hypoparathyreoïdie: stabiliteit van een nieuwe doseervorm voor continue subcutane infusie van recombinant parathyroïdhormoon (1-84)

 

Iatrogene hypoparathyreoïdie is een relatief veelvoorkomende complicatie na schildklierchirurgie [1,2]. De standaardbehandeling voor primaire hypoparathyreoïdie bestaat uit orale calcium- en vitamine D-analogen. In 2017 is recombinant humaan parathyroïdhormoon (rhPTH[1-84]) goedgekeurd voor gebruik bij therapieresistente hypocalciëmie. De beschikbaarheid van rhPTH(1-84) als aanvulling op de standaardzorg heeft enkele belangrijke voordelen opgeleverd, zoals een lager risico op chronische nierziekte en nefrolithiasis, evenals gunstige effecten op botdichtheid en kwaliteit van leven [3,4]. Het geneesmiddel is geregistreerd voor toediening als intermitterende subcutane injectie. Op basis van farmacokinetische en farmacodynamische argumenten kan echter worden gesteld dat continue toediening van rhPTH(1-84) gunstiger is dan eenmaaldaagse subcutane injecties, omdat dit de fysiologische productie van parathyroïdhormoon het best benadert [5].

Recombinant humaan parathyroïdhormoon (Natpar) is geregistreerd in een herbruikbare pen met patronen in vier verschillende sterktes, die na reconstitutie 14 doses bevatten van respectievelijk 25, 50, 75 en 100 microgram [6]. De injectiepen is niet geschikt voor continue (off- label) toediening van rhPTH(1-84) via subcutane infusie. Het overbrengen van de rhPTH(1-84)-oplossing in een reservoir en het toedienen van de oplossing via een pomp voor continue subcutane infusie kan een manier zijn om deze beperking te omzeilen. Voor dit doel lijkt het gebruik van een insulinepomp, zoals gebruikt door patiënten met diabetes mellitus, een geschikte manier voor dagelijks gebruik. Insulinepompen worden dicht op het lichaam gedragen. Daarom moet de stabiliteit van de rhPTH(1-84)-oplossing bij lichaamstemperatuur gedurende de gehele toedieningsperiode, tot maximaal 7 dagen, worden gegarandeerd.

De stabiliteit van de gereconstitueerde rhPTH(1-84)-oplossing in de geregistreerde pen is maximaal 14 dagen bij koelkasttemperatuur (2-8 °C) en maximaal 3 dagen bij kamertemperatuur (tot 25 °C) binnen deze 14-daagse gebruiksperiode [6]. Voor zover bekend, zijn er geen gegevens over de stabiliteit van rhPTH(1-84) bij lichaamstemperatuur, noch over de stabiliteit in een draagbaar pompreservoir met een bijbehorende infusieset voor continue subcutane infusie. Volgens de GMP-Z3 Aseptische handelingen is de maximale houdbaarheid van aseptisch klaargemaakte geneesmiddelen onder maximale productbescherming 1 maand bij koelkasttemperatuur, gevolgd door 7 dagen bij kamertemperatuur, mits zij fysisch en chemisch stabiel zijn [7].

Het doel van deze studie is het ontwikkelen van een off-label doseervorm voor opslag en continue subcutane infusie van rhPTH(1-84) en om de fysische en chemische stabiliteit van rhPTH(1-84) bij koelkasttemperatuur en bij lichaamstemperatuur te bepalen.

Op basis van een verwacht doseringsbereik van 25 tot 100 microgram per dag voor continue subcutane toediening van rhPTH(1-84) werd het patroon met 25 microgram per dosis, resulterend in een oplossing van 1 mL met een concentratie van 350 μg/mL, gekozen voor het vullen van het reservoir. De verwachte infusiesnelheid bij deze concentratie was 72-288 μL/24 uur, overeenkomend met een dosering van 25 tot 100 microgram per dag.

De Medtronic Paradigm Veo 754-insulinepomp (3,0 mL) werd gebruikt om het geneesmiddel nauwkeurig toe te dienen bij deze lage snelheid. Deze pomp wordt toegepast in combinatie met een Medtronic MiniMed-reservoir en een MiniMed Mio-infusieset. Het Medtronic Mini Med-reservoir bestaat uit een 3,0 mL spuit en een dubbelzijdige transfernaald. Het Medtronic MiniMed-reservoir is CE-gemarkeerd en goedgekeurd voor het vullen met snelwerkende U-100 insuline.

Het rhPTH(1-84)-patroon (Natpar, lot nr. Z1902AA07, exp. 04-2022) werd voor toediening gereedgemaakt volgens de instructies in de SmPC [6]. Een visuele controle op deeltjes werd uitgevoerd voorafgaand aan het vullen van het reservoir. Om een drukverschil te creëren werd eerst 1 mL lucht in het reservoir opgetrokken. Vervolgens werd het septum van het patroon doorboord door de transfernaald van het reservoir en werd de lucht in het patroon geïnjecteerd. Daarna werd het reservoir ondersteboven gekeerd en werd 1 mL van de rhPTH(1-84)-oplossing in het reservoir opgetrokken. De transfernaald werd losgekoppeld en vervolgens werd het reservoir in aluminiumfolie gewikkeld om het tegen licht te beschermen.

In alle experimenten werd het rhPTH(1-84)-gehalte bepaald met behulp van de Elecsys PTH(1-84)-assaykit met Cobas e 601 Analyzer (Roche, Basel, Zwitserland). Deze derde generatie PTH-assay meet specifiek het biologisch intacte molecuul van PTH, PTH(1-84). De Elecsys PTH- (1-84)-assay maakt gebruik van een sandwich-testprincipe, waarbij een gebiotinyleerd monoklonaal antilichaam reageert met het N-terminale fragment van PTH en een monoklonaal antilichaam gelabeld met een ruthenium complex reageert met het C-terminale fragment van PTH [8,9].

De assay is gestandaardiseerd tegen de NIBSC 95/646 (WHO)-standaard. De inter-assay variatiecoëfficiënt bedraagt 1,7-9,8% (bij waarden van 0,025-8,97 pmol/L) en de intra-assay variatiecoëfficiënt bedraagt 2,1-16,5% (bij 0,043-10,3 pmol/L).

De monsters werden vóór analyse 106 keer verdund in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, Apotheek A15, Gorinchem, Nederland) verrijkt met 5% Bovine Serum Albumine (BSA, VWR Life Science, Amsterdam, Nederland). Elk monster werd driemaal gemeten. Het gehalte werd berekend aan de hand van een standaardoplossing van 700 μg/mL.

Kwaliteitscontrolemonsters werden onafhankelijk bereid in concentraties van 62,5; 350 en 560 μg/mL rhPTH(1-84) in PBS verrijkt met 5% BSA.

SDS-PAGE (natriumdodecylsulfaat polyacrylamide-gelelektroforese) werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant om eiwitaggregaten en -fragmenten te visualiseren (Mini-PROTEAN Tetra Cell, Bio-Rad, Hercules, USA).

De pH van de monsters werd bepaald met een Metrohm 827 pH-meter (Metrohm, Herisau, Zwitserland) volgens de Europese Farmacopee (2.2.3 potentiometrische bepaling van pH) [10].

Het uiterlijk werd beoordeeld tegen een witte en zwarte achtergrond.

Om het stabiliteitsindicerend vermogen van de Elecsys PTH(1-84)-assaykit te bepalen, werd een geforceerde degradatiestudie uitgevoerd. De stresstesten zijn uitgevoerd op restmateriaal van rhPTH(1-84). Een oplossing van 350 μg/mL werd blootgesteld aan neutrale, zure, basische en oxiderende omstandigheden en bewaard in het donker bij kamertemperatuur en in een stoof bij 50 ± 2 °C. De neutrale testoplossing werd tevens aan licht blootgesteld.

Uiterlijk en PTH-concentraties werden bepaald op dag 0, 1 en 7. SDS-PAGE werd uitgevoerd op dag 0, 3 en 7.

De stabiliteit van rhPTH(1-84) in een reservoir werd onderzocht bij koelkasttemperatuur en bij lichaamstemperatuur. Om de optimale opslagconditie bij lichaamstemperatuur te bepalen, werd één monster aan licht blootgesteld en één monster beschermd tegen licht opgeslagen.

Voor de monstervoorbereiding werd de inhoud van twee reservoirs verdeeld over zes Medtronic MiniMed-reservoirs van 3,0 mL, overeenkomend met de drie opslagcondities in duplo. Om de opslagcondities bij patiënten na te bootsen, werden de reservoirs eerst 24 uur in de koelkast (2-8 °C) beschermd tegen licht opgeslagen. Daarna werden vier van de zes reservoirs aangesloten op een MiniMed Mio-infusieset met een naald van 6 mm en een slang van 80 cm. De slangen van de infusieset werden volledig gevuld met de rhPTH(1-84)-oplossing. Twee reservoirs met slang werden opgeslagen in een stoof (37 ± 2 °C) met continue blootstelling aan licht met behulp van een lamp (4000 K, 23 W, 220-240 V). De twee andere reservoirs met slang werden opgeslagen in een stoof (37 ± 2 °C) beschermd tegen licht. Het vijfde en zesde reservoir zonder de infusieset werden opgeslagen in de koelkast (2-8 °C), beschermd tegen licht.

Temperaturen werden gelogd met behulp van een Testo 174-datalogger (1 meting per 5 minuten). Op het moment van bemonstering werd eerst een deel van de vloeistof verworpen om een gemiddelde infusiesnelheid van 14,2 μL/24 uur na te bootsen. De duur van de stabiliteitsstudie was respectievelijk 14 en 56 dagen bij een temperatuur van 37 ± 2 °C en bij 2-8 °C. Het monsternameschema en de testen op elk bemonsteringsmoment worden gepresenteerd in tabel 1. Uiterlijk en pH werden direct na bemonstering bepaald. Monsters werden, indien van toepassing, voorbewerkt zoals hierboven beschreven en opgeslagen bij −20 °C voordat testen op aggregaten (SDS-PAGE) en gehalte (PTH[1-84]-assay) werden uitgevoerd.

De initiële concentratie van rhPTH(1-84) op t = 0 dagen werd gesteld op 100%. Alle daaropvolgende concentraties werden uitgedrukt als een percentage van de initiële concentratie. Eindconcentraties tussen 80% en 120% van de initiële concentratie werden als stabiel beschouwd.

Om te bepalen of rhPTH(1-84) adsorbeert aan de slang van een MiniMed Mio-infusieset en het Medtronic MiniMed-reservoir van 3,0 mL, werd een aanvullend experiment uitgevoerd. Twee infusiesets en één reservoir werden gevuld met rhPTH(1-84)-oplossing. De infusiesets werden opgeslagen bij lichaamstemperatuur en het reservoir bij koelkasttemperatuur. Na 24 uur werd de rhPTH(1-84)-oplossing uit de slangen en het reservoir verwijderd. Na eenmalig spoelen werden de slangen en het reservoir gevuld met een blanco-oplossing met dezelfde samenstelling als het geregistreerde product Natpar, behalve rhPTH(1-84). Na 24 uur werd de rhPTH(1-84)-concentratie gemeten in deze oplossing.

De correlatiecoëfficiënt voor de kalibratiecurve was ≥ 0,999 (n = 9). De variatiecoëfficiënt van de kwaliteitscontrolemonsters lag binnen 5% (n = 21).

Na blootstelling aan stresscondities was bij alle condities een afname van de PTH-concentratie te zien, waarbij blootstelling aan basische omstandigheden de snelste afname liet zien. De SDS-PAGE liet fragmentatie zien bij alle condities, met uitzondering van de neutrale omstandigheden. De stresstesten toonden aan dat de Elecsys PTH(1-84)-assay in staat was intact rhPTH(1-84) te onderscheiden van gedegradeerd rhPTH(1-84).

De initiële concentraties op t = 0 dagen weken niet meer dan 3% af van het gedeclareerde gehalte van 350 μg/mL. Figuur 1 toont het concentratiebeloop van rhPTH(1-84) na opslag bij 2-8 °C (paneel A) en bij 37 ± 2 °C (paneel B). Behalve voor de meting op t = 56 dagen bij 2-8 °C (figuur 1A) vielen alle metingen bij koelkasttemperatuur binnen het interval van 80-120%. Figuur 1B toont dat de rhPTH(1-84)-oplossing gedurende 14 dagen bij lichaamstemperatuur binnen 80-120% van de initiële geneesmiddelconcentratie bleef. Er werd geen significant verschil waargenomen tussen de rhPTH(1-84)-oplossingen die aan licht waren blootgesteld en die tegen licht waren beschermd.

Een representatieve SDS-PAGE-gel wordt gepresenteerd in figuur 2. De gels toonden geen zichtbare degradatieproducten of aggregaten. De pH was stabiel (5,6 ± 0,1) gedurende de gehele studieperiode en het visuele uiterlijk van de monsters verschilde niet van de initiële oplossing.

De rhPTH(1-84)-concentratie van de spoelvloeistof bedroeg 0,5% uit beide slangen van het infusiesysteem en 0,7% uit het reservoir. De experimenten toonden aan dat er geen significante adsorptie van rhPTH(1-84) aan de slang van de MiniMed Mio-infusieset of het Medtronic MiniMed-reservoir van 3,0 mL plaatsvond.

Deze proof-of-principle studie toont de ontwikkeling van een doseervorm voor continue subcutane infusie van rhPTH(1-84), die stabiel is gedurende 7 dagen bij lichaamstemperatuur en 1 maand bij koelkasttemperatuur. De gevonden stabiliteit is voldoende voor gebruik in de dagelijkse praktijk en zou de weg kunnen openen voor een meer op maat gemaakte behandeling van patiënten met hypoparathyreoïdie.

Normaal gesproken wordt bij het uitvoeren van stabiliteitsonderzoek een stabiliteitsindicerende HPLC-methode ontwikkeld. Na technische problemen bij het ontwikkelen van een HPLC-methode, kozen we voor de combinatie van de Elecsys PTH(1-84)-assay en SDS- PAGE. Deze immunoassay maakt gebruik van conformationele epitoopspecifieke antilichamen, waardoor de detectie van correcte vouwing van het PTH-eiwit mogelijk is, terwijl een HPLC-assay dat niet doet. De toevoeging van SDS- PAGE maakt de detectie van gedegradeerd eiwit en aggregaten mogelijk.

De resultaten van onze stresstesten toonden aan dat de combinatie van de Elecsys PTH(1-84)-assay en SDS-PAGE stabiliteitsindicerend is. We kunnen chemische degradanten en conformationele varianten meten, evenals verschillen in eiwitconcentratie. We concludeerden dat de combinatie van deze assays betrouwbare resultaten gaf, omdat de controlemonsters binnen 5% van de theoretische concentratie lagen en op dezelfde manier waren bereid als alle testmonsters.

We beschouwden eindconcentraties van 80% tot 120% van de initiële concentratie als stabiel. De gehalte-eisen voor biologische producten hangen af van wat technisch mogelijk is, wat als veilig wordt beschouwd en hoe nauwkeurig metingen kunnen worden uitgevoerd [11]. In de studie van Sukovaty et al. werd een variatie van ± 20% gevonden in een stabiliteitsstudie van PTH met drie verschillende immunoassay-methoden [12]. Een variatie van ± 20% ligt ruim binnen het bereik van het menselijke circadiane ritme van PTH en wordt daarom als veilig beschouwd [13].

Een gehalte-eis voor eindconcentraties van 80-120% wordt ook gehanteerd voor andere biologische producten. Deze eis wordt gehanteerd door de Britse Farmacopee, bijvoorbeeld voor interferon beta 1a-injectie bij ≤ 8,8 μg interferon beta 1a en humane stollingsfactor IX (rDNA) poeder voor oplossing voor injectie [14,15].

Onze studie toont aan dat rhPTH(1-84) stabiel is bij koelkasttemperatuur gedurende ten minste 1 maand. Aseptisch klaargemaakte geneesmiddelen krijgen een maxi- male houdbaarheid van 1 maand toegewezen wanneer ze in de koelkast worden bewaard [7]. Daarom wordt de toename van de concentratie op t = 56 dagen niet als relevant beschouwd. In overeenstemming met onze bevindingen beschrijft de FDA Chemistry Review een stabiliteit tot 27 dagen van de gereconstitueerde Natpara-oplossing [16].

Onze studie toont aan dat de concentratie van rhPTH (1-84) bij lichaamstemperatuur gedurende de gehele periode van verwachte toediening binnen het bereik van 80120% blijft. Blootstelling aan licht had geen significante invloed op de stabiliteit. De waargenomen variatie in concentratie kan worden toegeschreven aan conformationele veranderingen van het eiwit na reconstitutie van het gevriesdroogde eiwit in het oplosmiddel [17]. Deze veranderingen komen vaker voor bij hogere temperaturen. Antilichamen die worden gebruikt om eiwitten te detecteren, zijn vaak afhankelijk van conformationele epitopen. Daarom kunnen conformationele veranderingen van het eiwit resulteren in veranderingen in de gemeten rhPTH(1-84)-concentratie. Een vergelijkbare variatie in PTH-concentratie werd ook gezien in de studie van Sukovaty et al. [12].

De initiële daling van concentratie bij lichaamstemperatuur kan mogelijk worden verklaard door de temperatuurovergang aan het begin van het experiment. Alle monsters werden eerst 24 uur bij koelkasttemperatuur bewaard, waarna de monsters van het experiment bij lichaamstemperatuur in een stoof van 37 °C zijn geplaatst. Een temperatuurstijging kan leiden tot reversibele conformationele veranderingen van eiwitten [17].

Een andere mogelijke verklaring voor de variatie van de rhPTH(1-84)-concentratie bij lichaamstemperatuur is adsorptie aan de slang van de infusieset of het reservoir. Eiwitten in waterige oplossingen staan bekend om hun adsorptie aan verschillende oppervlakken [17]. In een aanvullend experiment vonden we echter geen bewijs voor dergelijke adsorptie. Irreversibele binding kon in dit experiment echter niet worden uitgesloten.

Verdamping van oplosmiddel werd uitgesloten, omdat er geen volumeverlies werd waargenomen tijdens de bemonstering. Verdamping zou bovendien hebben geresulteerd in een stijging van de concentratie gedurende het totale stabiliteitsexperiment.

Voor zover wij weten, is dit de eerste studie die gegevens rapporteert over de stabiliteit van rhPTH(1-84) in een doseervorm voor continue subcutane infusie. Eerder rapporteerden verschillende casusbeschrijvingen de toediening van continue infusie van rhPTH(1-34) met behulp van verschillende insulinepompen [18-20]. rhPTH(1-34) is het actieve fragment (aminozuren 1-34) van endogeen humaan parathyroïdhormoon en omvat, in tegenstelling tot rhPTH(1-84), niet het gehele menselijke hormoon. In deze casussen werden verschillende soorten pompen gebruikt en werd het reservoir van de pomp om de drie dagen bijgevuld. De therapeutische effectiviteit werd uitsluitend gemeten door klinische surrogaatmarkers; dat wil zeggen de afwezigheid van het optreden van significante hypocalciëmie. Goede kwaliteitsgegevens over geneesmiddelstabiliteit waren niet beschikbaar. Onze studie biedt daarom waardevolle nieuwe inzichten in de praktische omgang en stabiliteit van continue subcutane infusie van rhPTH(1-84).

Sterke punten van ons onderzoek zijn de systematische aanpak, de combinatie van een rhPTH(1-84)-assay met SDS-PAGE, de hoge resolutie van de metingen en de combinatie van koelkast- en lichaamstemperatuurstabiliteit, met en zonder blootstelling aan licht.

Onze studie heeft enkele beperkingen. Ten eerste was er geen pomp aangesloten op het Paradigm-reservoir. We simuleerden echter een flow bij het bemonsteren (gemiddelde flow 14,2 μL/24 uur) en onderzochten de stabiliteit onder worstcaseomstandigheden, wat ook als een sterk punt kan worden beschouwd.

Ten tweede werd geen kwalificatie van het verpakkingsmateriaal uitgevoerd. Het Medtronic MiniMed-reservoir van 3,0 mL is bedoeld om elke drie dagen te worden vervangen, wat een maximale stabiliteit van drie dagen voor het geneesmiddel (insuline) in het reservoir bij lichaamstemperatuur suggereert. Een review uit 2013 bespreekt meerdere studies waarin wordt gesuggereerd dat insuline in verschillende reservoirs voor subcutane infusie tot 14 dagen stabiel is bij 37 °C [21]. De samenstelling van de commerciële formuleringen van de insuline- analogen en rhPTH(1-84), evenals de fysische en chemische eigenschappen van de eiwitten, zijn vergelijkbaar. Daarom wordt verwacht dat het reservoir ook geschikt zal zijn als verpakkingsmateriaal voor rhPTH(1-84). De resultaten van onze studie ondersteunen deze theorie.

Deze studie kan worden gezien als de eerste stap in de ontwikkeling van een doseervorm voor continue subcutane infusie van rhPTH(1-84). In deze proof-of-principle studie is geen volledige stabiliteitsstudie uitgevoerd, die in drievoud en met verschillende lotnummers zou moeten worden uitgevoerd [22,23]. We hebben de combinatie van rhPTH(1-84) in een Medtronic MiniMed-reservoir van 3,0 mL en een MiniMed Mio-infusieset met een naald van 6 mm en een slang van 80 cm onderzocht. Hoewel wordt verwacht dat rhPTH(1-84) ook stabiel is in vergelijkbare soorten reservoirs, zijn de resultaten van onze studie niet zonder meer generaliseerbaar naar andere reservoirs en infusiesets. Verder onderzoek is nodig om deze resultaten te bevestigen en om de resultaten meer generaliseerbaar te maken naar andere toedieningssystemen met verschillende soorten reservoirs en infusiesets.

Concluderend kan rhPTH(1-84) worden uitgevuld in een doseervorm voor continue subcutane infusie met behulp van een Medtronic MiniMed-reservoir van 3,0 mL en een MiniMed Mio-infusieset. rhPTH(1-84) is in deze doseervorm stabiel gedurende 7 dagen bij lichaamstemperatuur en 1 maand in de koelkast.